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磷酸三钙壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与(4)
3 讨论 Discussion
牙髓干细胞作为一种牙髓组织内含有的多种潜在的祖/干细胞[7],最早于2000 年被GRONTHOS 等[8]学者报道,这种细胞与骨髓干细胞具有相似的免疫表型,如CD90和CD105[9-10],且在体外用分化培养基处理后能够形成钙化结节。MONTERUBBIANESI 等[11]就人牙髓干细胞和其他干细胞在增殖能力和克隆形成能力方面进行比较后认为人牙髓干细胞具有更大的潜力。人牙髓干细胞已被证实可以分化为多种细胞类型,如成骨细胞、成牙本质细胞、软骨细胞等[12]。另外,由于牙髓干细胞来源较广,获取相对简便,这些都使得它成为一种更具有吸引力的种子细胞。但如何为牙髓干细胞提供适合的成骨环境则需要合适的支架材料作为支撑。
水凝胶作为一种三维亲水的交联聚合物网络[13],因其具有可膨胀不崩解、可吸收重于数倍自身质量的水分等特性而成为一种更为仿生的组织工程支架材料[14]。以往的20年中,已有学者研究了生物聚合物基质对羟基磷灰石的成核和矿化的影响,已经确定的是,带负电的基团如羧基能够吸引Ca2+离子,引导羟基磷灰石晶体成核和生长[15],而带正电荷的水凝胶能够吸引碳酸盐和磷酸盐等阴离子,因此拥有与此类似的效果[16]。该实验中选取了带正电荷的壳聚糖和能够为羟基磷灰石晶体生长提供钙、磷离子而较原始羟基磷灰石颗粒具有更匹配自然降解速率的β-磷酸三钙作为水凝胶材料的原材料构建仿生骨组织工程水凝胶,构建中,颗粒状态的β-磷酸三钙为水凝胶材料提供了粗糙的硬表面利于成骨细胞的定植和钙磷离子沉积[17],而壳聚糖作为水凝胶的多聚物基础,提供了较高的弹性模量,利于骨组织的形成[18]。
骨再生期间,生物矿化是使现有组织硬化或变硬的重要过程。最常见的生物矿物质是钙和磷酸盐,它们与有机聚合物(如胶原纤维等)结合形成磷灰石晶体,为骨骼提供结构支撑[19]。该实验中利用壳聚糖作为磷灰石的成核位点,利用β-磷酸三钙作为钙离子和磷酸盐的来源,用以加速生物矿化的过程。根据电感耦合等离子体发射光谱法检测结果,该实验将壳聚糖和β-磷酸三钙利用京尼平交联后,可观察到钙离子的稳定释放,为磷灰石晶体的形成提供了原料。
作为组织工程材料,实验所制备水凝胶利用具有良好生物相容性的壳聚糖和β-磷酸三钙进行构建,为验证其生物学效应,利用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。由结果可知,随着时间增加,各组细胞的数目不断增加,到第5 天之后细胞数目已不再具有显著性差异,其原因在于此时的细胞已经出现接触抑制,增殖减慢。在各个时间点上对照组和各实验组间增殖率没有统计学差异,从另一个方面说明水凝胶材料生物相容性良好,不影响牙髓干细胞的增殖。
LAINO 等[20]研究发现,当牙髓干细胞分化为前成骨细胞时能够沉积细胞外基质,形成钙化的编织骨组织,并可以此为准来评估生物材料的骨诱导性。钙化结节的形成代表着细胞成骨分化已到达晚期。该实验中使用茜素红与钙离子耦合形成橘红色沉淀物,从而直观显示出已形成的钙化结节的形态和数量。由图可知,含有β-磷酸三钙水凝胶中的钙化结节数量多于壳聚糖组和空白对照组,这表明与单纯壳聚糖水凝胶相比,β-磷酸三钙的添加促进了牙髓干细胞的钙化。
生理状态下人体内骨形成有赖于逐级发生的独立事件,包括干细胞向成骨细胞的分化、成骨细胞的增殖分化,最终通过终末分化的成骨细胞形成矿化的细胞外基质[21]。人体内的Ca2+波动通过诱导甲状旁腺素和1,25(OH)2-VD3的循环来影响这些过程[22],但是尚不清楚Ca2+对体外独立的成骨过程的影响。因此针对该实验制备的水凝胶对牙髓干细胞成骨过程的影响仍需要进一步实验证明。
结论:实验将β-磷酸三钙与壳聚糖2 种具有优良生物学特性的组织工程学材料相混合,互相弥补原有短板,制备出孔隙率高、孔径适合成骨细胞生长的新型水凝胶支架材料。利用电感耦合等离子体发射光谱法测定了第3,7,14,21 天水凝胶浸提液中钙元素的含量,在含有β-磷酸三钙的水凝胶浸提液中观察到了随时间延长缓释的钙元素增加,这些都十分有利于水凝胶在生物学上的应用。该实验所制备的水凝胶能够促进人牙髓干细胞的早期黏附和增殖,并能够促进人牙髓干细胞的成骨分化,在没有成骨诱导剂的情况下于第14 天已经能够观察到钙化结节的形成,这说明实验所得水凝胶具有良好的生物相容性和一定的骨诱导性,为制备新型组织工程学材料提供了新的思路。
文章来源:《煤矿现代化》 网址: http://www.mkxdh.cn/qikandaodu/2021/0717/1457.html
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