期刊封面
脂多糖预处理的牙囊细胞外泌体对牙周炎牙周膜(3)
<0.05),且浓度为100 μg/mL时的表达量更高;Col Ⅲ在100 μg/mL 外泌体组的表达为对照组以及10 μg/mL 外泌体组的2 倍(P <0.01),而TGF-β1 的表达则在10 μg/mL 外泌体组呈现出最高的表达量(P<0.01,图4)。
细胞茜素红染色结果显示,与对照组比较,10、100 μg/mL 浓度的外泌体组均可见到茜素红染料标记的阳性矿化结节(F=237.761,P<0.01),且100 μg/mL 外泌体组钙结节数量多于10 μg/mL 组(P<0.01,图5)。
Figure 3 Identification of exosomes图3 外泌体的鉴定a:transmission electron microscopy detected that L-Exos were vesicle-like structures;b:nanoparticle tracking analysis determined that the size distribution of L-Exos was mainly approximately 100 nm;c:surface markers of exosomes(CD63,Alix)and cell markers(Actin)were detected by Western blotting;L-Exos:LPS-pretreated DFC-derived exosomes
Figure 4 The expression of L-Exos-induced p-PDLC osteogenic and adhesion-related genes was detected by RT-PCR图4 RT-PCR 检测L-Exos 对p-PDLCs 成骨相关基因表达ColⅠ:CollagenⅠ;Col Ⅲ:Collagen Ⅲ;TGF-β1:transforming growth factor-β1;L-Exos:LPS pretreated DFCs derived exosome;p-PDLCs:periodontal ligament cells of periodontitis;**:P<0.01 ;##:P<0.01 vs.10 μg/mL
3 讨 论
Figure 5 Alizarin red staining and quantitative analysis of L-exos-induced p-PDLC osteogenesis induction after 7 d图5 L-Exos 对p-PDLCs 成骨诱导7 d 茜素红染色及半定量分析a:general and microscopic view of Alizarin red staining;b:semiquantitative analysis of Alizarin red staining;L-Exos:LPS-pretreated DFCderived exosomes;p-PDLCs:periodontal ligament cells of periodontitis;**:P<0.01 ;##:P<0.01 vs.10 μg/mL
越来越多的研究表明MSCs 除了通过自我增殖分化加速组织修复外,还可通过其分泌外泌体等调节内源性干细胞分化、增殖从而促进受损的组织的愈合[12]。基于目前的研究,外泌体的提取方法主要为蔗糖-密度梯度离心法、超速离心法、超滤法以及商品化试剂盒法(类似于聚合物沉淀)等[13]。由于目前外泌体提纯技术的局限性,无论是超速离心法还是试剂盒法提取的外泌体均可能含有小的细胞外囊泡或其他成分,如同等大小的脂质体、蛋白质等,而不是单纯的外泌体[14]。因此针对提取方法的选择问题,国际细胞外囊泡协会指出提取方法的选择应以所需的囊泡纯度和浓度为指导[13]。本实验旨在初步探究牙囊细胞外泌体对p-PDLCs 的作用,因此选用商品化的试剂盒作为本实验外泌体的提取方法。在本研究中,透射电镜结果显示外泌体形态大小不一,直径在30~100 nm 之间,具有脂质双分子层结构,NTA 检测外泌体粒径分布发现外泌体样本大小峰值在100 nm,这些特性同先前文献结果是一致的[15]。此外,根据蛋白质组学研究,与细胞相比,外泌体特异性表达四跨膜蛋白,如CD63、肿瘤易感基因101 蛋白(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、Alix 等[15]。本实验Western Blot 结果显示提取的外泌体样本高表达CD63、Alix 而不表达Actin,由此认为通过本实验方法提取的是牙囊细胞外泌体。
DFCs在牙发育过程中分化形成牙骨质、牙周膜以及牙槽骨,是形成牙周组织的前体细胞,取材方便,增殖分化能力强,是牙周组织工程中常用的一种种子细胞[1]。同时本课题组的前期研究将牙龈卟啉单胞菌来源的LPS 预处理DFCs 24 h 后其细胞膜片表现出较PDLCs更强的成骨、成胶原能力,更有利于牙周组织再生[2]。然而,LPS 预处理后的DFCs 分泌的外泌体对牙周组织作用的机制尚不明确。
研究表明,MSC 分泌的外泌体可促进组织内源性细胞增殖和分化能力。而目前外泌体对于牙周组织再生的研究是局限的。Jiang 等[16]发现乳鼠切牙MSCs 外泌体在浓度为10 μg/mL 时能明显升高上皮细胞碱性磷酸酶活性,牙本质涎蛋白表达,促进矿化物质形成,效果优于浓度为0.1 μg/mL、1 μg/mL 的MSCs 外泌体。Chew 等[17]将40 μg MSCs外泌体载入胶原海绵中治疗大鼠牙周缺损发现,MSCs 外泌体通过增强PDLCs 的增殖分化功能促进牙周缺损的骨修复,但结果中的牙槽骨的再生效果不佳,而高浓度的外泌体对细胞分化影响尚不明确,如何提高外泌体的效能是急需解决的问题。本研究发现100 μg/mL L-Exos 上调p-PDLCs 成骨相关基因ColⅠ、Col Ⅲ的表达以及黏附相关基因Periostin 的表达。Periostin 是一种基质细胞蛋白,可调节细胞迁移、募集、黏附,表达于各种组织的愈合区域[18],在牙周组织及其周围骨的再生中起重要作用[19]。ColⅠ是最早发现的成骨细胞标志物之一,它在成骨前体细胞中表达上调并沉积为细胞外基质,是早期成骨细胞分化的标志[20]。Col Ⅲ对胶原弹性有重要作用,在组织修复初期Col Ⅲ含量较高,随后逐渐被ColⅠ替代[21]。这些基因的表达水平上调均能调控牙周骨组织再生,增强p-PDLCs的成骨能力。研究表明,TGF-β1 对间充质细胞和某些其他特定细胞类型如牙周膜细胞、成纤维细胞,和成骨细胞等具有增强细胞活性,促进细胞生长的能力[22]。在本实验中,TGF-β1 基因在10 μg/mL L-Exos 组相对表达量明显高于100 μg/mL L-Exos组,这表明在诱导7 d 后,10 μg/mL L-Exos 组p-PDLCs 增殖活性较强,而100 μg/mL L-Exos 组p-PDLCs 成骨向分化能力较强,进而证明100 μg/mL L-Exos 较10 μg/mL L-Exos 具有更强的促进p-PDLCs成骨向分化能力,益于牙周组织再生。
文章来源:《煤矿现代化》 网址: http://www.mkxdh.cn/qikandaodu/2021/0717/1461.html