期刊封面
磷酸三钙壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与(2)
根据以下公式计算孔隙率:
其中v1为样品支架孔体积,v2为样品支架表观体积,ε为样品支架孔隙率,ρ为乙醇密度,将相同支架重复测定3 次,取平均值。使用Original pro 软件观察。
1.4.4 水凝胶浸提液中钙浓度检测 制备好的水凝胶成胶后放于6 孔板中,每孔添加1 mL DMEM 培养基,放入37 ℃,体积分数为5%CO2生化培养箱中孵育。收集第3,7,14,21 天的培养基,使用电感耦合等离子体发射光谱法进行水凝胶浸提液中钙浓度检测。
1.4.5 水凝胶材料的生物相容性及成骨性能
(1)人牙髓干细胞的获取和培养:于南方医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊收集16-25 岁健康青年的正常无龋恒牙,需无明显龋损、无牙髓炎、无根尖周炎。该研究经南方医科大学口腔医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。将恒牙沿牙颈部磨沟,沿沟槽劈开恒磨牙,暴露内部的牙髓组织,组织镊小心夹取牙髓组织,组织剪剪碎牙髓组织,离心后弃去上清,加入新鲜DMEM 培养基反复吹打直至组织分散均匀,吸取适量混悬液滴入6 孔板中央,盖玻片压紧。待见到细胞自盖玻片下爬出后将盖玻片翻开,换液,继续培养至长满6 孔板,利用胰酶消化分离得到人牙髓干细胞,接种于25 cm3培养瓶中,添加DMEM 培养基,在37 ℃,体积分数为5%CO2饱和湿度的条件下静置培养,待牙髓干细胞长至80%融合成片时进行传代。
人牙髓干细胞的培养及鉴定细胞来源: 人牙髓组织原代培养方法: 组织块贴壁法基础培养基: 低糖DMEM 培养基添加材料: 体积分数为10%胎牛血清+双抗原代培养时间: 原代细胞培养2 d 开始换液;之后每2 d 换液1 次,培养至牙髓干细胞生长至80%融合成片开始传代细胞传代: 细胞融合至80%用胰酶消化传至下1 代,按1 ∶3 比例传代,细胞生长至80%传1 代,共传5-7 代细胞鉴定: 流式鉴定、成骨诱导分化伦理学批准: 该实验经过南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)伦理委员会审查
(2)流式细胞术鉴定人牙髓干细胞:选取CD90、CD29和CD44 作为间充质干细胞的标志;选取CD105 作为内皮细胞的标志;选取CD34、CD45 作为造血干细胞的标志。胰蛋白酶消化获得第3 代人牙髓干细胞的单细胞悬浮液,使用荧光染料缀合表面标志物:CD29/PE,CD34/PE,CD90/PE,CD44/FITC,CD45/PE,CD105/FITC,40 g/L 多聚甲醛固定细胞,FACS 缓冲液(PBS+1%BSA+0.1%NaN3)染色和洗涤细胞后,用Guava?easyCyte8HT 台式流式细胞仪进行分析。
(3)人牙髓干细胞的成骨诱导:第3 代牙髓干细胞培养至融合度达到80%-90%时,用0.25%%EDTA 进行消化,按照2×104/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的6 孔板中,每孔加入2 mL 完全培养基,置于37 ℃,体积分数为5% CO2培养箱中进行培养。当细胞融合度达到60%-70%时,小心吸弃孔内完全培养基,加入2 mL OriCell人牙髓干细胞成骨诱导分化完全培养基,每隔3 d 换液1 次,诱导21 d 后进行茜素红染色,操作如下:吸弃6 孔板中的成骨诱导分化完全培养基,用1×PBS 冲洗一两次,每孔加入2 mL 体积分数4%中性甲醛溶液固定30 min,1×PBS 冲洗2 次,每孔加入1 mL 茜素红染液染3-5 min,1×PBS 冲洗两三次,将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
(4)细胞活力检测:利用CellTiter-Lumi?发光法细胞活力检测试剂盒检测第1,3,5,7 天的细胞活力,操作如下: 取出细胞培养板在室温平衡10 min(通常不宜超过30 min),96孔板每孔加入100 μL CellTiter-Lumi?发光法检测试剂,室温振荡2 min,以促进细胞的裂解;室温(约25 ℃)孵育10 min,使发光信号趋于稳定;使用多功能酶标仪进行化学发光检测,根据化学发光读数直接计算细胞的相对活力。
(5)人牙髓干细胞在水凝胶材料上的钙化结节观察:在铺好水凝胶材料的6 孔板中调整细胞密度为1×105,第14 天和第21 天进行茜素红染色,光镜下观察染色情况。
1.5 主要观察指标 ①水凝胶的形态及孔径;②水凝胶孔隙率;③水凝胶材料浸提液中的钙含量;④牙髓干细胞在水凝胶上的生长以及钙化结节生成情况。
1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计分析软件。数据以x-±s表示,进行析因方差分析。每一时间段的组间比较,先用Levene 检验方差齐性,其中方差齐性进行One-Way ANOVA分析,同时采用S-N-K 组间两两多重比较;若方差不齐采用Welch 稳健方差分析,并采用Dunnett’s T3 进行组间两两多重比较。为探讨时间和组别对细胞增殖性的协同作用,进行单因素重复测量的方差分析。假设检验为双侧检验,检验水准为P=0.05,以P< 0.05 为差异有显著性意义。
文章来源:《煤矿现代化》 网址: http://www.mkxdh.cn/qikandaodu/2021/0717/1457.html
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