期刊封面
脂多糖预处理的牙囊细胞外泌体对牙周炎牙周膜(2)
< 220 nm)置于100 KD 的超滤管中,5 000 g/min 离心30 min,得到分子粒径为30~220 nm 的上清浓缩液,并置于-80 ℃冰箱备用。浓缩液按2∶1 的体积加入外泌体提取试剂,充分混匀,4 ℃孵育过夜,10 000 g/min 离心60 min,沉淀即为L-Exos。将离心后得到的白色沉淀溶于生理盐水后,2%戊二醛固定1 h,进行透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察外泌体的结构;纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术分析外泌体粒径分布范围;蛋白印迹(Western Bolt)法检测其表面标记物。
外泌体溶解在RIPA裂解缓冲液中,通过BCA方法计算蛋白总量后,将裂解液与蛋白缓冲液按比例混合,最终将浓度调至为1 μg/μL[9]。将封闭后的膜分别与CD63(1∶1 000,Zen Bioscience,China,)、Alix(1∶1 000,Zen Bioscience,China,)和Actin(1∶1 000,Abcam,ab3280)的一抗在4 ℃过夜,然后在室温下二抗孵育1 h,进行检测。
1.4 经LPS 刺激DFCs 后的外泌体对p-PDLCs 的分化影响
1.4.1 RT-PCR P3 代的p-PDLCs 以5 × 105个细胞/孔的细胞数接种至12 孔板,待细胞贴壁至60%约24 h 后,将L-Exos 重悬于培养基中分别以10、100 μg/mL 的浓度加入p-PDLCs 中(对照组加入相应剂量的PBS),在诱导7 d 后,每孔加入500 μL Trizol 裂解液,分离提取RNA,并逆转录为cDNA[10]。利用RT-PCR 仪进行荧光定量检测分化相关基因:Periostin、Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Col Ⅲ、转化生长因子-化(transforming growth factorβ1,TGF-β1),引物序列见表1。
表1 引物序列Table 1 Primer sequenceGene Periostin Col ⅠCol ⅢTGF-β1 GAPDH Forward 5′-CACTCTTTGCTCCCACCAATA-3′5′-AACATGGAGACTGGTGAGACCT-3′5′-TGGAGGATGGTTGCACGAAA-3′5′-CACGTGGAGCTGTACCAGAA-3′5′-GTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′Reverse 5′-ATTTCCTTCCAGCGTCTCAA-3′5′-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3′5′-ACAGCCTTGCGTGTTCGATA-3′5′-GAACCCGTTGATGTCCACTT-3′5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′
1.4.2 L-Exos对p-PDLCs成骨的影响 将P3代的p-PDLCs 分别以5×105个细胞/孔接种于12孔板中,待细胞贴壁至60%约24 h后,将L-Exos重悬于成骨诱导培养基中分别以10、100 μg/mL的浓度加入p-PDLCs中。7 d 后,弃上清,PBS 洗涤,4%多聚甲醛固定15 min,按参照文献方法[11]进行茜素红染色、矿化结节的观察以及半定量分析。其中成骨诱导液为含5 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL 维生素C、100 mmol/L 地塞米松、10%FBS 的α-MEM 培养液。
1.5 统计学方法
采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析,多组均值的比较采用单因素方差分析,组间比较运用Bonferroni 法进行两两比较,检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 DFCs 与p-PDLCs 的培养
在DFCs 分离培养3 d 后,细胞开始从组织块中缓慢爬出,爬出的细胞以组织为中心呈放射状向周围排列,长梭形,胞体饱满,偶有散在上皮团从组织块分离,10 d 后多处组织块中大部分的细胞已分离爬出,细胞生长汇合达培养瓶的60%~70%(图1a)。p-PDLCs分离培养4~7 d后开始有少量p-PDLCs 迁移出组织块,无序排列,为典型的成纤维样。15~20 d 后爬出的细胞增多,呈旋涡状或放射状细胞簇散在铺于培养皿(图1b)。
Figure 1 The cell culture of DFCs and p-PDLCs图1 牙囊细胞和牙周炎患者的牙周膜细胞原代培养a:dental folic cells(DFCs);b:periodontal ligament cells of periodontitis(p-PDLCs);bar=500 μm
2.2 DFCs 的鉴定
DFCs 的表面标记物CD73、CD90、CD146 阳性表达,并且CD31、CD106、CD34 显示阴性,因此分离培养的DFCs 来源于间充质干细胞,并非造血干细胞来源(图2)。
Figure 2 Flow cytometry analysis for DFCs图2 DFCs 的流式细胞术分析DFCs positively expressed CD73,CD90 and CD146,while negatively expressed CD31,CD106 and CD34;DFCs:dental folic cells
2.3 外泌体的鉴定
L-Exos 是直径为30~100 nm 的囊泡样结构,囊泡周缘可观察到脂质双分子层(图3a)。将白色沉淀溶于生理盐水后,纳米颗粒追踪分析结果如图3b 示,所提取的L-Exos 直径大小的峰值主要分布在100 nm 左右。运用Western Blot 检测囊泡表面标记物CD63 、外泌体特有标记物ALG-2 相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X,Alix)以及细胞的表面标记物肌动蛋白水平,结果显示提取物强阳性表达CD63 和Alix,不表达细胞表面标记物Actin,而对照组细胞的结果则与之相反(图3c)。进而证明,该方法提取的分离物为外泌体。
2.4 L-Exos 对p-PDLCs 成骨向分化的影响
RT-PCR检测Periostin、Col Ⅰ、Col Ⅲ、TGF-β1的表达,10、100 μg/mL L-Exos组中Periostin和Col Ⅰ的表达均高于对照组(P
文章来源:《煤矿现代化》 网址: http://www.mkxdh.cn/qikandaodu/2021/0717/1461.html